2023年5月Protein & Cell刊发了题为“A molecular brake that modulates spliceosome pausing at detained introns contributes to neurodegeneration”的封面文章，生命中心、清华大学医学院贾怡昌教授研究组发现了mRNA转录后调控新机制，为神经退行性疾病的发生提供了全新机制。

前体mRNA剪接（pre-mRNA splicing）是一种在基因表达过程中非常重要的调控步骤，它负责将前体mRNA中的内含子（intron）剪除，并将外显子（exon，编码蛋白质的部分）连接起来，形成成熟的mRNA，以便在翻译过程中产生功能性蛋白质。超过90%的人类基因都经历过可变剪接（alternative splicing），可变剪接指的是在前体mRNA分子中，把同一基因的外显子通过不同的剪接方式组合在一起，产生多种不同的mRNA，从而编码出多样的蛋白质。因此，前体mRNA剪接（pre-mRNA splicing）对于基因功能调节和蛋白多样性有重要作用。近年来越来越多的证据提示，前体mRNA剪接异常导致的相关RNA代谢紊乱可能是导致神经退行性疾病的重要原因。

内含子保留（intron retention）是可变剪接的其中一种模式，它指的是在转录过程中，部分内含子未被剪接出去，而是保留在成熟的转录本中。然而由于内含子通常会在转录本中引入提前终止密码子，而携带提前终止密码子的转录本会被无义介导的mRNA降解（nonsense-mediated decay, NMD）机制所降解，一般认为不会有蛋白质产物。2015年，美国诺奖得主Phillip Sharp的团队发现一类内含子滞留的转录本（intron-detaining transcripts），这类转录本在细胞核内定位，几乎已经完成所有成熟mRNA的后加工，作为一种转录后调控机制来精细调控基因表达(Genes Dev. 2015)。考虑到人类基因的平均大小在30kb左右，mRNA的转录速率约2-4kb/分钟，巴塞尔大学Peter Scheiffele等人提出内含子保留的转录本可以使细胞快速应对周围环境变化，因为内含子滞留的转录本在快速响应环境变化时，无需经历耗时的mRNA转录过程(Neuron. 2016)。然而，我们仍不清楚这其中的分子机制以及这一过程中的错误调控会导致的生物学后果。

在过往的研究中，已知U2 snRNA（U2 small nuclear RNA）是参与前体mRNA 剪接的重要成分。2012年，贾怡昌博士等在小鼠大脑中发现U2 snRNA一个5个核苷酸的缺失，这种突变可以导致大量的内含子滞留的转录本和神经退行性疾病（Cell, 2012）。基于这个发现，在本次研究中，我们通过致突变剂介导的小鼠正向遗传学筛选，鉴定到SNIP1（Smad Nuclear Interacting Protein 1）的半剂量不足可以大大缓解U2突变所致的内含子滞留的转录本堆积和神经退行性病变。我们的研究成果包括：

1） 90%以上的内含子滞留的转录本仅包含1-2个内含子，这样更有利于细胞快速响应产生成熟mRNA。

2） 既往报道的U2突变并没有增加新的内含子滞留的转录本，而是让这些转录本在细胞核里堆积。

3） 这些滞留的内含子的序列在进化上高度保守，内含子滞留的转录本在小脑的发育过程中被精细地调控。

4） 剪接体（spliceosome）在行使剪接功能过程中，存在多个中间状态，其中B^act（activated spliceosome）是一个重要的中间态，B^act剪接体虽然已被活化但不具备催化活性，只有经过一系列构象和组成的转变才能成为B*（catalytically activated spliceosome），具有完成第一步剪接转酯分支反应（transesterification）的能力。我们发现SNIP1存在于B^act，利用SNIP1和B^act蛋白而非B*蛋白的RNA蛋白互作技术，可以富集内含子滞留的转录本。基于这个结果，我们首次提出剪接体暂停的概念（Spliceosome pausing），并且提出剪接体在内含子滞留的转录本上被暂停在B^act中间态。

5） SNIP1和RNPS1（RNA Binding Protein With Serine Rich Domain 1）的相互作用调控内含子滞留，其中RNPS1通过同时结合内含子滞留的转录本和SNIP1，将剪接体暂停在b^act中间态；

6）最后，在小脑颗粒神经元中条件性敲除Snip1会导致内含子滞留的转录本积累，提示SNIP1作为剪接体蛋白促进剪接体实现内含子滞留的转录本的剪接。

图1. 剪接体暂停（Spliceosome pausing）的工作原理和对神经退行性疾病的贡献。组成型剪接的内含子（Constitutive intron）和滞留的内含子（Detained intron）的剪接具有不同的动力学特性，前者是与转录同时发生（Co-transcriptional）而后者是发生于转录后（Post-transcriptional）。突变型（如U2的突变或Snip1条件敲除）或功能失调（如衰老）的剪接体，对组成型内含子剪接影响较小，更易影响滞留的内含子，这可能成为疾病致病的重要贡献因素。

本次研究中，我们在老年小鼠脑中观察到大量内含子滞留的转录本堆积。鉴于在神经退行性病人的大脑中也发现有大量内含子滞留的转录本（Aging Cell. 2019），此次报道的剪接体暂停（Spliceosome pausing）的工作原理，可能对神经退行性疾病的发病机制具有重要贡献（图1）。

清华-北大生命科学联合中心/清华大学生命科学院毕业生孟大为博士是论文的第一作者,贾怡昌教授是论文的通讯作者。清华大学医学院博士生郑倩、清华大学医学院博士后张雪、清华大学生命学院朴学娇博士、清华大学脑与智能实验室罗莉博士均有重要贡献。本工作获得了生命科学联合中心、IDG/麦戈文研究所、国家自然科学基金和北京市科学技术委员会等基金的支持。

[1] Boutz, P.L., Bhutkar, A., and Sharp, P.A. (2015). Detained introns are a novel, widespread class of post-transcriptionally spliced introns. Genes Dev 29, 63-80.

[2] Mauger, O., Lemoine, F., and Scheiffele, P. (2016). Targeted Intron Retention and Excision for Rapid Gene Regulation in Response to Neuronal Activity. Neuron 92, 1266-1278.

[3] Adusumalli, S., Ngian, Z.K., Lin, W.Q., Benoukraf, T., and Ong, C.T. (2019). Increased intron retention is a post‐transcriptional signature associated with progressive aging and Alzheimer’s disease. Aging cell 18, e12928.